ny/t 2897-威尼斯37266

中华人民共和国农业行业标准

ny/t 2897-2016

饲料中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛的测定 高效液相色谱法

determination of β-apo-8'-carotenal in feeds-

high performance liquid chromatography

前言

  本标准按照gb/t 1. 1-2009给出的规则起草。

  本标准由农业部畜牧业司提出。

  本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(sac/tc 76)归口。

  本标准起草单位：华中农业大学、广州汇标检测技术中心、广州立达尔生物科技有限公司、帝斯曼(中国)有限公司。

  本标准主要起草人：张妮娅、齐德生、陈雷、高思。

1范围

  本标准规定了饲料中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛的高效液相色谱测定方法。

  本标准适用于添加剂预混合饲料、浓缩饲料及配合饲料中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛的测定。本标准的方法检出限为0.6 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。

2规范性引用文件

  下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

  gb/ t 6682分析实验室用水规格和试验方法

  gb/t 14699.1饲料采样方法

  gb/t 20195动物饲料样品的制备

3原理

  试样中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛经甲醇、正己烷和乙酸乙酯提取后，在氮气保护下浓缩，用流动相重溶，注入高效液相色谱仪中进行分离，紫外检测器检测，外标法测定样品中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛含量。

4试剂和材料

  除特别说明外，所有试剂均为分析纯试剂，试验用水符合gb/t 6682 中三级用水规定，色谱用水符合gb/t 6682中一级用水规定。

4.1 甲醇。

4.2饱和氯化钠溶液：将氯化钠逐步加入100ml水中，搅拌，直至氯化钠不再溶解，上清液即为饱和氯化钠溶液。

4.3 正己烷。

4.4乙酸乙酯。

4.5冰乙酸。

4.6 无水乙醇。

4.7甲基叔丁基醚。

4.8乙酸溶液(0. 05%)：取0.5 ml冰乙酸于1 l容量瓶中，用水定容。

4.9 提取剂：将甲醇、乙酸乙酯、正己烷按照体积比为1：1：1混合均匀。

4.10甲基叔丁基醚-甲醇(1 1)溶液：将甲基叔丁基醚和甲醇按照体积比为1：1混合均匀。

4.11 β-阿朴- 8'-胡萝卜素醛标准品(含量大于96%)。

4.12 β-阿朴-8'-胡萝卜素醛标准储备液：称取β-阿朴-8'-胡萝卜素醛标准品0.05 g(精确至0.000 1g)，用甲基叔丁基醚-甲醇溶液(4.10)溶解，转入100ml棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为500 mg/l的β-阿朴-8'-胡萝卜素醛标准储备液。4℃下避光保存，有效期为6个月。

4.13 β-阿朴-8'-胡萝卜素醛标准工作液：取β-阿朴-8'胡萝卜素醛标准储备液(4.12)，用甲基叔丁基醚甲醇溶液(4.10)逐级稀释成浓度为0.5 μg/ ml、1.0 μg/ ml、2.0 μg/ ml、4.0 μg/ ml、8.0 μg/ ml的系列标准工作液。

5仪器

5.1 分析天平：感量0.0001g。

5.2高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

5.3氮吹仪。

5.4 0.45μm微孔滤膜。

6试样的采集与制备

  按gb/t 14699.1采集有代表性的样品，用四分法缩减取样。按gb/t 20195 制备样品，粉碎过0.45 mm孔径的试验筛，混合均匀，装入密闭容器中，低温保存备用。

7分析步骤

7.1试样溶液的制备

  称取试样0.5g~2.0g(m)，精确到0.0001g，于事先加入10ml水的锥形瓶中，再分别加入饱和氯化钠溶液(4.2)2.0ml、0.05%乙酸溶液(4.8)10.0ml，摇匀。用提取剂(4.9)萃取3次，每次15 ml，将上层萃取液合并后，加入2.0ml无水乙醇(4.6)，于30℃下氮气吹干。用甲基叔丁基醚-甲醇溶液(4.10)4.0 ml(v1)溶解残余物，通过0.45μm微孔滤膜过滤制成试样溶液。以上操作均在避光通风柜内进行。试样溶液避光冷藏，24 h内完成上机测定。

7.2 测定

7.2. 1色谱参考条件

色谱柱：c30柱，250mm，内径4.6 mm，粒度5.0μm；

流动相：a相为甲醇、水三乙胺混合溶液(90 10 0.1)，b相为甲基叔丁基醚-甲醇-水-三乙胺混合溶液(90 6 4 0.1)；

梯度洗脱程序：按表1执行；

进样量：20 μl；

流速：1 ml/min；

检测波长：462 nm；

柱温：35℃。

表1流动相梯度洗脱程序

7.2.2标准工作曲线的绘制

  分别取20μl不同浓度的β-阿朴- 8'-胡萝卜素醛标准工作液(4.13)上机测定。以浓度(c)为横坐标，峰面积(a)为纵坐标，绘制标准工作曲线，得出回归方程。

  β-阿朴-8'-胡萝卜素醛标准溶液的色谱图参见附录a。

7.2.3 样品测定

  取20μl试样溶液(7.1)在高效液相色谱仪上测定峰面积，根据回归方程(7.2.2)计算试样溶液中β-阿朴- 8'-胡萝卜素醛的浓度(c₀)。

8结果计算

饲料中β-阿朴- 8'-胡萝卜素醛的含量x，以质量分数[毫克每千克(mg/kg)]表示，按式(1)计算。

式中：

m——试样质量，单位为克(g)；

c——由标准工作曲线查得的试样溶液中β-阿朴-8'-胡萝卜素醛的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；

v1——用 于溶解残余物的甲基叔j基醚甲醇溶液的体积(7.1)，单位为毫升(ml)。

  测定结果用两次平行测定后的算术平均值标识，结果保留一位小数。

9重复性

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果与这两个测定值算术乎均值的绝对差值，在测定结果小于或等于50 mg/kg时，不大于该平均值的15% ；测定结果大于50mg；时，不大于该平均值的10%。