ny/t 4310-威尼斯37266

中华人民共和国农业行业标准

ny/t 4310-2023

饲料中吡啶甲酸铬的测定 高效液相色谱法

determination of chromium picolinate in feeds-

high performance liquid chromatography

前言

  本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

  请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

  本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。

  本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（sac/tc 76）归口。

  本文件起草单位：浙江省兽药饲料监察所。

  本文件主要起草人：任玉琴、吴望君、罗成江、侯轩、王彬、裘丞军、陈晓林、黄娟。

1范围

  本文件描述了饲料中吡啶甲酸铬的高效液相色谱测定方法。

  本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中吡啶甲酸铬的测定。

  本文件配合饲料、浓缩饲料、精料补充料的检出限为0.05mg/kg定量限为0.1mg/kg.添加剂预混合饲料的检出限为0.1 mg/kg、定量限为0.5 mg/kg。

2规范性引用文件

  下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

  gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法

  gb/t 20195动物饲料 试样的制备

3术语和定义

  本文件没有需要界定的术语和定义

4原理

  试样中的吡啶甲酸铬用乙腈提取，经浓缩净化后，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。

5试剂或材料

  除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

5.1水：gb/t 6682，一级。

5.2乙腈：色谱纯。

5.3甲醇。

5.4 10%乙腈溶液：量取10ml乙腈；加水至100 ml混匀。

5.5乙腈溶液饱和的正己烷：量取正已烧900/ml，加10%乙腈溶液（5.450ml混匀，静置，取上层溶液。

5.6磷酸盐缓冲液（ph7.0）：称取三水合磷酸氢二钾5.7g、无水磷酸二氢钾3.4g，加水溶解并定容至1 000 ml，混匀。

5.7标准储备溶液（250μg/ml）：称取吡啶甲酸铬标准品（cas号： 14639-25-9，纯度≥98.0%）25 mg（精确至0.01 mg），置于100 ml容量瓶中，加乙腈（5.2）超声溶解，用乙腈定容，混匀。2℃~8 ℃保存，有效期6个月。

5.8标准中间溶液（25μg/ml）：准确移取标准储备溶液（5.7）10 ml于100 ml容量瓶中，用水定容，摇匀。临用现配。

5.9标准系列溶液；准确移取标准中间溶液（5.8）适量，用水定容，配制成浓度分别为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/m、2.0μg/ml、5.0μg/ml标准系列溶液。临用现配。

5. 10 固相萃取柱：混合型阴离子交换柱，500 mg/6ml。

5.11 微孔滤膜：0.45μm，有机系。

6仪器设备

6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。

6.2分析天平：精度 0.01 mg、0.1 mg和1 mg。

6.3离心机：转速不低于 8 000 r/min。

6.4氮吹仪。

6.5超声波清洗器。

6.6 涡旋混合器。

7样品

  按（gb/t 20195制备样品，粉碎使其全部通过0.45mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，备用。

8试验步骤

8.1 提取

  平行做2份试验。称取配合饲料约5 g、浓缩饲料和精料补充料3 g~5 g、添加剂预混合饲料约1 g，精确至0.1mg，置于50ml离心管中，加入乙腈（5.2）25ml，涡旋或超声（超声温度不超过50℃）20 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液，置于容量瓶中。残渣用乙腈（5.2）25 ml重复提取1次，合并2次提取液，用乙腈（5.2）定容至50 ml，混匀。

8.2 浓缩、净化

8.2.1配合饲料、浓缩饲料、精料补充料

  准确移取提取液（8.1）5 ml~50 ml（v1，相当于吡啶甲酸铬0.5μg~50μg），于50℃下用氮气吹至近干，加5.00 ml 10%乙腈溶液（5.4） ，超声或涡旋使溶解，加乙腈溶液饱和的正己烷（5.5）3 ml除脂，涡旋10 s，8 000 r/min离心3 min，取下层清液1.00 ml（v2） ，加3 ml水，混匀，为试样溶液a。取固相萃取柱（5.10）依次用5 ml甲醇（5.3）和5 ml水预淋洗，取试样溶液a全部过柱，用8 ml乙腈（5.2）洗脱， 收集洗脱液，于50℃下用氮气吹至近干，加2.00ml（v3）10%乙腈溶液（5.4）超声或涡旋使溶解，用0.45μm微孔滤膜（5.11）过滤，滤液为试样溶液。

8. 2.2添加剂预混合饲料

  准确移取提取液（8.1）5ml~50ml（v1，相当于含吡啶甲酸铬0.25μg~25μg），置于离心管中，于50℃下用氮气吹至近干，准确加入5ml 10%乙腈溶液（5.4），超声或涡旋使溶解，8000r/min离心5 min，取上清液用0.45μm微孔滤膜（5.11）过滤，滤液为试样溶液。

8.3液相色谱参考条件

色谱柱：c18柱，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5μm，或性能相当者；

柱温：30℃；

检测波长： 264 nm；

流速：0.8 ml/min；

进样量：50μl；

流动相：a为乙腈（5.2）；b为磷酸盐缓冲液（5.6），梯度洗脱程序见表1。

8.4 测定

8.4.1标准系列溶液和试样溶液测定

  在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（5.9）和试样溶液（8.2.1或8.2.2）上机测定。吡啶甲酸铬标准溶液的液相色谱图见附录a。

8.4.2定性

  以保留时间定性，试样溶液中吡啶甲酸铬色谱峰的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中吡啶甲酸铬色谱峰的保留时间一致，其相对偏差应在±2.5%。

8.4.3定量

  以吡啶甲酸铬的浓度为横坐标.色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中吡啶甲酸铬的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用10%乙腈溶液（5.4）稀释后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中吡啶甲酸铬的峰面积与标准溶液中吡啶甲酸铬的峰面积相差不超过30%。

9试验数据处理

  配合饲料、浓饲缩饲料、精料补充料试样中吡啶甲酸铬的含量以质量分数ω计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按公式（1）计算，单点校准按公式（2）计算。

式中：

ρ——从标准曲线查得的试样溶液中吡啶甲酸铬质量浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/ml）；

50——提取液总体积的数值，单位为毫升（ml）；

5——第一次氨吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

v1——移取提取液体积的数值，单位为毫升（ml）；

v2——除脂后移取下层清液体积的数值，单位为毫升（ml）；

v3——第二次氮吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

m——试样质量的数值，单位为克（g）。

a——试样溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积；

as——标准溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积；

cs——标准溶液中吡啶甲酸铬质量浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/ml）；

50——提取液总体积的数值，单位为毫升（ml）；

5——第一次氮吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

v1——移取提取液体积的数值，单位为毫升（ml）；

v2——除脂后移取下层清液体积的数值，单位为毫升（ml）；

v3——第二次氮吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

m——试样质量的数值，单位为克（g）。

添加剂预混合饲料试样中吡啶甲酸铬的含量以质量分数ω计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按公式（3）计算，单点校准按公式（4）计算。

式中：

ρ——从标准曲线查得的试样溶液中吡啶甲酸铬的质量浓度.单位为微克每毫升（μg/ml）；

50——提取液总体积的数值，单位为毫升（ml）；

5——氮吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

v1——移取提取液体积的数值，单位为毫升（ml）；

m——试样质量的数值，单位为克（g）。

a——试样溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积；

as——标准溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积；

cs——标准溶液中吡啶甲酸铬质量浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/ml）；

50——提取液总体积的数值。单位为毫升（ml）；

5——氮吹后复溶体积的数值，单位为毫升（ml）；

v1——移取提取液体积的数值，单位为毫升（ml）；

m——试样质量的数值，单位为克（g）。

测定结果以平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

10精密度

  当吡啶甲酸铬含量≤05mg/kg时，在重复性条件下，2次独立测试结果与算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。

  当吡啶甲酸铬含量>0.5mg/kg时，在重复性条件下2次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。