gb 5009.89-威尼斯37266

中华人民共和国国家标准

gb 5009.89-2023

食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定

前言

  本标准代替gb 5009.89-2016《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》。

  本标准与gb 5009.89-2016相比，主要变化如下：

  ——高效液相色谱法调整为第一法，微生物法调整为第二法；

  ——增加了第二法 微生物法中的微孔板法、试样处理后调节ph的要求；

  ——修改了第二法 微生物法的标准曲线浓度范围、精密度和定量限。

1范围

  本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。

  本标准第一法适用于调制乳粉、特殊膳食用食品（不包括乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方以及氨基酸代谢障碍配方的特殊医学用途婴儿配方食品）和特殊用途饮料中烟酸和烟酰胺的测定，第二法适用于食品中烟酸（或烟酰胺）的测定。

第一法 高效液相色谱法

2原理

  样品经酶解、沉淀蛋白质等前处理后，在弱酸性环境下超声波振荡提取，以c18色谱柱分离，用紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，计算试样中烟酸和烟酰胺含量。

3试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1盐酸（hcl）：优级纯。

3.1.2氢氧化钠（naoh）：优级纯。

3.1.3甲醇（ch3oh）：色谱纯

3.1.4异丙醇（c3h8o）：色谱纯。

3.1.5庚烷磺酸钠（c7h15nao3s）：色谱纯。

3.1.6淀粉酶：酶活力≥1.5 u/mg。

3.2 试剂配制

3.2.1盐酸溶液（5.0 mol/l）：量取415 ml盐酸，加水定容至1 000 ml。

3.2.2盐酸溶液（0.1 mol/l）：吸取8.3 ml盐酸，加水定容至1 000 ml。

3.2.3氢氧化钠溶液（5.0 mol/l）：称取200 g氢氧化钠，加水定容至1 000 ml。

3.2.4氢氧化钠溶液（0.1 mol/l）：吸取20 ml氢氧化钠溶液（5.0 mol/l），加水定容至1 000 ml。

3.3 标准品

3.3.1烟酸（c6h5no2，cas号：59-67-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.3.2烟酰胺（c6h6n2o，cas号：98-92-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.4标准溶液配制

3.4.1烟酸和烟酰胺标准储备溶液（1.000mg/ml）：将烟酸（或烟酰胺）标准品置入含五氧化二磷的干燥器中，千燥过夜。准确称取各0.1 g（精确到1 mg），用0.1 mol/l 盐酸溶解，定容至100 ml。2℃~8℃冷藏可保存1个月。

3.4.2烟酸和烟酰胺标准混合中间液（100.0μg/ml）：准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液各10.0ml于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。2℃~8℃冷藏可保存1个月。

3.4.3烟酸和烟酰胺标准混合工作液：分别准确吸取标准混合中间液1.0ml、2.0ml、5.0ml、10.0ml、20.0 ml于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，得到质量浓度分别为1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml的标准混合工作液。临用现配。

4仪器和设备

4.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。

4.2天平：感量分别为0.1 mg和0.01 g。

4.3恒温培养箱：30℃~80℃。

4.4超声设备。

4.5ph计：精度为0.1。

4.6粉碎机。

5分析步骤

5.1样品前处理

5.1.1试样制备

  样品预处理：取有代表性的样品至少200g，块状或颗粒状样品用粉碎机粉碎，粉末状、糊状或液体样品充分混匀，置于密闭的容器内。

5.1.2淀粉类和含淀粉的食品

5.1.2.1称取混合均匀固 体试样约5.0 g（精确到0.01 g），置于150 ml锥形瓶中，加入约25 ml45℃~50℃的水，加入约0.5 g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞，置于50℃~60℃的培养箱内酶解约30min，取出冷却至室温。

5.1.2.2称取混合均匀液体试样约20.0 g（精确到0.01 g），置于150 ml锥形瓶中，加入约0.5 g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞，置于50℃~60℃的培养箱内酶解约30min，取出冷却至室温。

5.1.3不含淀粉的食品

5.1.3.1称取混合均匀固体试样约5.0 g（精确到0.01 g），置于150 ml锥形瓶中，加入约25 ml

45℃~50℃的水，置于超声设备中振荡约10 min以上充分溶解，静置5 min~10 min，冷却至室温。

5.1.3.2称取混合均匀液体试样约20.0 g（精确到0.01 g），置于150 ml锥形瓶中，置于超声设备中振荡约10 min以上，充分溶解，静置5 min~10 min，冷却至室温。

5.1.4试样提取

  待试样溶液降至室温后，用5.0 mol/l盐酸溶液和0.1 mol/l盐酸溶液调节试样溶液的ph至1.7±0.1，放置约2 min后，再用5.0 mol/l氢氧化钠溶液和0.1 mol/l 氢氧化钠溶液调节试样溶液的ph至4.5±0.1，置于50℃水浴超声设备中振荡10 min以上，充分提取，冷却至室温后转至100 ml（v）容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于100 ml（v）容量瓶中，用水定容至刻度后混匀，经滤纸过滤。滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤，用样品瓶收集，即为试样测定液。

  注1：必要时，试样测定液用水进行适当的稀释（f），使试样测定液中烟酸和烟酰胺质量浓度在1μg/ml~20μg/ml范围内。

  注2：推荐充氮条件：压力0.055 mpa~ 0.062 mpa氮气充氮30 s。

5.2液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a）液相色谱柱：c18（粒径5μm，250 mm×4.6 mm）或等效柱。

b）流动相：甲醇70 ml、异丙醇20 ml、庚烷磺酸钠1 g，用910 ml水溶解并混匀后，用盐酸调节ph至2.1±0.1。

c）柱温：25℃±0.5℃。

d）流速：1.0 ml/min。

e）进样量：20μl。

f）紫外检测波长：261 nm。

5.3标准工作曲线的制备

  按照已经确立的色谱条件，将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液依次按上述推荐色谱条件进行测定（标准样品色谱图见附录a中图a.1）。记录各组分的色谱峰面积，以标准测定液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.4试样溶液的测定

  将试样测定液按上述推荐色谱条件进样测定。记录各组分色谱峰面积，根据标准曲线计算出试样测定液中烟酸及烟酰胺各组分的质量浓度ρ。

6分析结果的表述

6.1试样 烟酸或烟酰胺含量计算

试样中烟酸或烟酰胺的含量按式（1）计算。

式中：

x——试样中烟酸或烟酰胺的含量， 单位为微克每百克（μg/100 g）；

ρ——由标准曲线得到的试样溶液中烟酸或烟酰胺的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；

v——样品定容的体积，单位为毫升（ml）；

100——单位换算系数；

n——试样的取样量，单位为克（g）；

f——稀释倍数。

6.2试样烟酸和烟酰胺总含量计算

试样中烟酸和烟酰胺的总含量（以烟酸计）按式（2）计算。

式中：

x——试样中烟酸和烟酰胺总含量（以烟酸计），单位为微克每百克（μg/100 g）；

x1——试样中烟酸含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；

x2——试样中烟酰胺含量，单位为微克每百克（μg/100g）。

计算结果保留3位有效数字。

  注：烟酰胺的结果乘以系数1.008，可以折算为烟酸的结果。

7精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

8其他

  固体样品：当称样量为5g时，烟酸检出限为30μg/100g，定量限为100μg/100g，烟酰胺检出限为40 μg/100 g，定量限为120 μg/100 g。

  液体样品：当称样量为20 g时，烟酸检出限为7.5 μg/100 g，定量限为25 μg/100 g，烟酰胺检出限为10 μg/100 g，定量限为30 μg/100 g。